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pcr技术dna模板如何获得

更新时间:2019-08-12      

  第二种从mRNA逆转录获得,在这种情况下,mRNA的cDNA,与原来的基因组DNA相同而且无内含子;相反地,对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3末端的poly A序列等的核苷序列上,与外显子序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。

  cDNA 文库(cDNA library ): 是指某生物某一发育时期所转录的mRNA 全部经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。最快开奖结果现场直播。 cDNA 文库与基因组文库的最主要的区别是,基因组文库含有而cDNA 文库不含非转录的基因组序列(重复序列等)。

  与基因组文库- 一样,cDNA 文库也是指一群含重组DNA 的细菌或噬菌体克隆。每个克隆只含一种mRNA 的信息,足够数目克隆的总和包含了细胞的全部mRNA 信息。cDNA 文库便于克隆和大量扩增,可以从中筛选到所需目的基因,并用于表达。

  不论是由细胞总DNA 建立的基因组文库,还是由mRNA 逆转录而成的cDNA 建立的cDNA 文库,都是混合物,还要对文库进行筛选,直到获得目的基因。

  以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

  cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中,在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因,因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

  1. 如果需要的DNA是来自于样品的基因组,则需要抽提基因组DNA,这样可以获得绝大多数样品的DNA,以用于作为模板。由于不同样品的抽提方式不同,采用的试剂也各不一样,可以参考网页:的信息,里面包含了植物,动物,细菌等的基因组抽提方法,还是比较全面的。当然,也可以直接购买基因组DNA抽提试剂盒。

  2.如果需要的DNA是质粒,可以直接购买质粒提取试剂盒,或者是参照《分子克隆》上质粒抽提的方法来进行质粒的分离。这样获得的DNA可以避免基因组DNA的干扰。但是对于特别大的质粒,可能只能用手动方法进行提取。

  3.最简单的方式是直接PCR,不抽提DNA,直接对样品进行煮沸,或者是裂解的处理,取一部分溶液作为模板扩增即可。只要溶液中含有少量的DNA就可以成功扩增。但此种方法的缺点是,由于未对DNA进行分离,所以含有杂质较多,有可能会干扰到扩增的效果,例如效率或者是特异性等。

  追问中提到的基因组文库,实际上是很多构建好的质粒,所以从文库中获得DNA的话,一般是采用质粒提取的方法。所以需要了解,构建文库的载体都是什么类型的质粒,以确认相应的抽提方式。